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Der Film erzählt die Geschichte der vier bekannten Turtles Leonardo, Michelangelo, Rapahel und Donatello, die von ihre Lehrmeister Splinter über viele Jahre von der Außenwelt abgeschirmt wurden. Nun versuchen die Teenager mit allen Mitteln, von den Menschen der Stadt New York akzeptiert zu werden. Dabei setzen sie auch auf die Hilfe ihrer neuen Freundin April. Verkompliziert wird die Sache allerdings, als eine Horde von Mutanten auf die Stadt losgelassen wird.
Zum englischen Sprechercast von Teenage Mutant Ninja Turtles: Mutant Mayhem gehören unter anderem Seth Rogen als Bebop, John Cena als Rocksteady, Giancarlo Esposito als Baxter Stockman, Paul Rudd als Mondo Gecko, Ice Cube als Superfly, Rose Byrne als Leatherhead, Hannibal Buress als Genghis Frog, Natasia Demetriou als Wingnut, Post Malone als Ray Fillet and Maya Rudolph als Cynthia Utrom.
Die Inszenierung des Films übernahm Jeff Rowe, der vor allem durch den Netflix-Animationsfilm Die Mitchells gegen die Maschinen bekannt ist. Das Drebuch stammt von Brendan O'Brien.